Genome-wide RNAi analysis of Caenorhabditis elegans fat regulatory genes; C. elegans Major Fats Are Stored in Vesicles Distinct from Lysosome-Related Organelles

Nature. 2003 Jan 16;421(6920):268-72.

Kaveh Ashrafi, Francesca Y Chang, Jennifer L Watts, Andrew G Fraser, Ravi S Kamath, Julie Ahringer, Gary Ruvkun.

ナイルレッドという色素を使って線虫の脂肪を染色・定量する方法を確立するとともに、ゲノムワイドなRNAiスクリーニングにより脂肪蓄積に関わる遺伝子を大量に同定（したはずだった）。Ruvkun研にいたAshrafiら。2003年。

https://www.nature.com/articles/nature01279

Cell Metab. 2009 Nov;10(5):430-5.

Eyleen J O'Rourke, Alexander A Soukas, Christopher E Carr, Gary Ruvkun.

ナイルレッドなど旧来の脂肪染色法で染まるのはリソソームに関連するオルガネラで、実際の脂肪の量を反映しないことを報告。オイルレッドOという色素を使うべきと主張。上述の論文を含め、過去の大量の関連論文の解釈が難しくなるというまさかの展開に。Ruvkun研。2009研。

https://www.cell.com/cell-metabolism/fulltext/S1550-4131(09)00301-5

このような経緯を知らずに（？）、古い染色法を使ったり、それらを使った過去の論文を引用して議論する論文がいまだにあって、混乱が続いてしまっている。

Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences

EMBO J. 1991 Dec;10(12):3959-70.

C C Mello, J M Kramer, D Stinchcomb, V Ambros.

外来DNAを線虫の生殖腺に微量注入して、形質転換する方法の開発。導入したDNAは、他の多くの生物種と異なり染色体DNAに挿入されず（稀に挿入されるが）、染色体外で多コピーのアレイ（Extrachromosomal array）を形成する。当時ハーバード大のMelloら。1991年。

https://www.embopress.org/doi/abs/10.1002/j.1460-2075.1991.tb04966.x

こんなに簡単に形質転換を起こせる種でなかったら（それなりに熟練は必要だが）、モデル生物としてここまで広まっていたかどうか…。この時代の線虫研究者は運が良かった？

Immobilizing nematodes for live imaging using an agarose pad generated with a Vinyl Record

The Worm Breeder's Gazette, July 18, 2017

Katherine Andrea Rivera-Gomez, Mara Schvarzstein.

「レコード盤」（レコ大など言葉として残っていても、もはや見たことない人が多い？）の上でアガロースを固め、レコードの溝（音溝）に沿ってできた壁で線虫を固定することで姿勢の良い線虫を顕微鏡観察する方法。ニューヨーク市大ブルックリン校のSchvarzstein研。2017年。

http://wbg.wormbook.org/2017/07/18/immobilizing-nematodes-for-live-imaging-using-an-agarose-pad-generated-with-a-vinyl-record/

CeMbio - The Caenorhabditis elegans Microbiome Resource

G3 (Bethesda). 2020 Sep 2;10(9):3025-3039.  

Philipp Dirksen, Adrien Assié, Johannes Zimmermann, Fan Zhang, Adina-Malin Tietje, Sarah Arnaud Marsh, Marie-Anne Félix, Michael Shapira, Christoph Kaleta, Hinrich Schulenburg, Buck S Samuel.

自然界でC.エレガンスと共生する代表的な腸内微生物を13種類選び、そのコレクションをCeMbioと命名。腸内微生物叢と宿主動物の相互作用をクリーンかつ遺伝学的に研究できるモデルになると主張。ベイラー医科大Samuel研など多数。2020年。

https://www.g3journal.org/content/10/9/3025

ConVarT: a search tool for orthologous variants: A method and server for functional inference of human genetic variants

bioRxiv.

Mustafa S. Pir, Halil I. Bilgin, Ahmet Sayici, Fatih Coşkun, Furkan M. Torun, Pei Zhao, Yahong Kang, Sebiha Cevik, Oktay I. Kaplan.

ヒト・マウス・線虫で報告された変異/バリアントが、別の２種に存在するオーソログではどのような変化に相当するかを調べられるウェブツール（ConVarT）の報告。アブドラ・ギュル大学（トルコ）のKaplan研。2021年1月9日プレプリント。

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.01.07.424951v2

Simultaneous Expression of Multiple Proteins Under a Single Promoter in Caenorhabditis elegans via a Versatile 2A-Based Toolkit

Genetics. 2014 Mar;196(3):605-13.

Arnaud Ahier, Sophie Jarriault.

一つのmRNAから複数のタンパク質を発現させる方法として、前投稿のSL2を利用する方法に加えて、2Aペプチドがある。タンパク間に2Aペプチドを入れると、リボソームが2Aに達したところで翻訳が終了し、次のタンパクの翻訳が始まる。線虫での使用の最初の報告はストラスブール大学Jarriault研。2014年。

https://www.genetics.org/content/196/3/605.long

（補足：SL2と2Aの使い分け）

SL2ドナー配列を挟む方法は、下流の遺伝子の発現がおよそ半分に減ってしまうが、遺伝子産物に余計なペプチドを付加せずに済む。2Aペプチドは、上流遺伝子に2Aペプチド（約20アミノ酸）の大半が余計に付加されてしまうが、上流/下流の遺伝子をほぼ同量発現させられる。

そもそもどういう時に１つのmRNAから複数タンパク質を発現させたくなるかというと、例えば「導入する遺伝子が転写されているか確かめたいが、GFPを直接つなぐのは機能が阻害されるので避けたい」とか、「同じプロモーターで複数遺伝子を発現させたいが、普通に並べるとDNAが長すぎる」といった状況。

Trans-splicing in C. elegans generates the negative RNAi regulator ERI-6/7

Nature. 2008 Sep 25;455(7212):491-6.

Sylvia E J Fischer, Maurice D Butler, Qi Pan, Gary Ruvkun.

隣り合って逆向きに転写される2つの遺伝子（eri-6とeri-7）が、異なるmRNA間のスプライシング（トランススプライシング）で一つの転写産物としてつながり、RNA干渉を制御。ExonとExonがつながるトランススプライシングの報告は線虫で初めて。Ruvkun研。2008年。

https://www.nature.com/articles/nature07274

ショウジョウバエのmod(mdg4)遺伝子やlola遺伝子でも、トランススプライシングで異なるRNAがつながることで機能性の転写因子が合成される。トランススプライシングはヒト細胞でも起こるが、今のところ意義はあまりわかっていない。

https://academic.oup.com/gbe/article/8/3/562/2574122

線虫では70%以上のmRNAでトランススプライシングが起こり、5′端にSL1・SL2と呼ばれる2種類のSL（spliced leader）配列のどちらかがつながる。トリパノソーマなども同様のトランススプライシングが頻繁に起こる。

http://www.wormbook.org/chapters/www_transsplicingoperons/transsplicingoperons.html

SL2スプライスドナーを含むgpd-2/3遺伝子由来の配列を2つのコーディング領域に挟むと、2つのコーディング領域がトランススプライシングで2つに分かれてどちらも翻訳される。一つのプロモーターから二種類のタンパク質を同時に発現させたいときによく用いられる。

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/009286749390139H

Genome Sequence of the Nematode C. elegans: A Platform for Investigating Biology

Science. 1998 Dec 11;282(5396):2012-8.  

The C. elegans Sequencing Consortium

MRCのSulstonやワシントン大セントルイスにいたWaterstonが中心となって、8年がかりでC. elegansのゲノム配列を解読。線虫はゲノムが読まれた最初の多細胞生物となった。1998年。SulstonとWaterstonはその後のヒトゲノム解読プロジェクトでも旗振り役となった。

https://science.sciencemag.org/content/282/5396/2012/tab-pdf

Buckets of Worms

Worm Breeder's Gazette 8(2): 56

A.O.W. Stretton, C.D. Johnson, P. Anderson.

250リットルの培地で増やした大腸菌を餌にして、1.35kgものC. elegansを培養して集めた実験のレポート。集めた線虫は、食べると「ガルバンソ豆のような見た目だが、鶏肉のような味」。ウィスコンシン大学マディソン校のStrettonら。1984年。

http://wbg.wormbook.org/wli/wbg8.2p56/

Visualizing the metazoan proliferation-quiescence decision in vivo

Elife. 2020 Dec 22;9:e63265.

Rebecca C Adikes, Abraham Q Kohrman, Michael A Q Martinez, Nicholas J Palmisano, Jayson J Smith, Taylor N Medwig-Kinney, Mingwei Min, Maria Danielle Sallee, Ononnah B Ahmed, Nuri Kim, Simeiyun Liu, Robert D Morabito, Nicholas Weeks, Qinyun Zhao, Wan Zhang, Jessica L Feldman, Michalis Barkoulas, Ariel M Pani, Sabrina Leigh Spencer, Benjamin Louis Martin, David Q Matus.

サイクリン依存性キナーゼの活性に応じて核局在が変化する蛍光タンパク質センサーを線虫とゼブラフィッシュに発現させて、細胞分裂周期のどの状態にあるかを可視化できることを報告。ストーニーブルック大学Matus研など。2020年12月22日。

https://elifesciences.org/articles/63265

Random and targeted transgene insertion in Caenorhabditis elegans using a modified Mos1 transposon

Nat Methods. 2014 May;11(5):529-34.

Christian Frøkjær-Jensen, M Wayne Davis, Mihail Sarov, Jon Taylor, Stephane Flibotte, Matthew LaBella, Andrei Pozniakovsky, Donald G Moerman, Erik M Jorgensen.

短く改良したMos1トランスポゾン（miniMos）で、長い外来遺伝子（45kbまで）を染色体にランダムに挿入できることを報告。この技術で、同じMosSCIベクターを全染色体に挿入できるようにした株（universal MosSCI）や、蛍光レポーター・lacOの挿入株を多数作製。Frøkjær-Jensenら。2014年。

https://www.nature.com/articles/nmeth.2889

Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans;Improved Mos1-mediated transgenesis in C. elegans

Nat Genet. 2008 Nov;40(11):1375-83.  

Christian Frøkjær-Jensen, M Wayne Davis, Christopher E Hopkins, Blake J Newman, Jason M Thummel, Søren-Peter Olesen, Morten Grunnet & Erik M Jorgensen.

Nat Methods. 2012 Jan 30;9(2):117-8.

Christian Frøkjær-Jensen, M Wayne Davis, Michael Ailion, Erik M Jorgensen.

MosTICを応用し、染色体上の特定の場所に外来遺伝子を1コピーだけ挿入する手法（MosSCI）の報告。挿入場所は限定されるが、十分に実用的なレベルで形質転換効率が高いので広く普及した。どちらもFrøkjær-Jensenら。2008年と2012年。

https://www.nature.com/articles/ng.248

https://www.nature.com/articles/nmeth.1865

Targeted gene deletions in C. elegans using transposon excision

Nat Methods. 2010 Jun;7(6):451-3.

Christian Frøkjaer-Jensen, M Wayne Davis, Gunther Hollopeter, Jon Taylor, Todd W Harris, Paola Nix, Rachel Lofgren, Michael Prestgard-Duke, Michael Bastiani, Donald G Moerman, Erik M Jorgensen.

Mos1トランスポゾンが標的遺伝子の近くに（たまたま）入った株でMos1を飛ばすことでDNA切断を誘導し、相同組み換えで標的遺伝子をノックアウトする方法（MosDEL）。Frøkjær-Jensenら。2010年。

https://www.nature.com/articles/nmeth.1454

Targeted engineering of the Caenorhabditis elegans genome following Mos1‐triggered chromosomal breaks

EMBO J. 2007 Jan 10;26(1):170-83.

Valérie Robert, Jean-Louis Bessereau

CRISPR-Cas9以前は線虫はゲノム編集が難しかったと前に書いたが、Mos1トランスポゾンがたまたま都合いい場所に挿入された株でMos1を飛ばすことでDNAを切断し、ゲノム編集する方法（MosTIC）が使われていたこともあった。パリ高等師範学校のBessereau研。2007年。

https://www.embopress.org/doi/full/10.1038/sj.emboj.7601463

線虫のゲノムを自由に編集できるように、Mos1の挿入場所が同定された変異株を大量に作製・保存・配布するコンソーシアム（NemaGENETAG）が活動していたこともあった。しかし現在ではCRISPR-Cas9の登場で必要性が薄れてしまい、ほとんどの株は入手できなくなっているようだ。

https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0030482

Engineering rules that minimize germline silencing of transgenes in simple extrachromosomal arrays in C. elegans

Nat Commun. 2020 Dec 9;11(1):6300.

Mohammed D Aljohani, Sonia El Mouridi, Monika Priyadarshini, Amhed M Vargas-Velazquez, Christian Frøkjær-Jensen.

PATCを多く含むイントロンの挿入など様々な方法を組み合わせて、外来遺伝子を生殖腺で（ゲノムに挿入せずに）簡単に安定発現させる方法の報告。KAUST（サウジアラビア）のFrøkjær-Jensen研。2020年12月9日。

https://www.nature.com/articles/s41467-020-19898-0

Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system

Nat Methods. 2013 Aug;10(8):741-3.

Ari E Friedland, Yonatan B Tzur, Kevin M Esvelt, Monica P Colaiácovo, George M Church, John A Calarco.

今年ノーベル賞が出たCRISPR-Cas9の線虫への応用を最初に報告。同じような試みが片手（両手？）に余るほどの研究室で行われる熾烈な競争となったが、遺伝子破壊についてはハーバード大のCalarcoらがわずかに先着。2013年。

https://www.nature.com/articles/nmeth.2532

GFPノックインなどの相同組み換えを利用したゲノム編集についてはUNCのGoldstein研とMRCのde Bono研がほぼ同着。2013年。

https://academic.oup.com/nar/article/41/20/e193/2414882

https://www.nature.com/articles/nmeth.2641

他の研究室の多くも調整できたようで、少しずつ違うアプローチでほぼ同時にGeneticsに報告。2013年。当事者は相当なストレスだったのでは？

https://www.genetics.org/content/195/2/331

https://www.genetics.org/content/195/3/1177

https://www.genetics.org/content/195/3/1167

https://www.genetics.org/content/195/3/1181

https://www.genetics.org/content/195/3/1173

https://www.genetics.org/content/195/3/1187

線虫は酵母やマウスと比較してDNAを自由に書き換えるゲノム編集が難しかったので、このことが線虫の最大の弱点と言われることもあったが、CRISPR-Cas9の登場でこの問題は解決した（使うにはそれなりに熟練が必要だが…）。

An Abundant Class of Non-coding DNA Can Prevent Stochastic Gene Silencing in the C. elegans Germline

Cell. 2016 Jul 14;166(2):343-357.  

Christian Frøkjær-Jensen, Nimit Jain, Loren Hansen, M Wayne Davis, Yongbin Li, Di Zhao, Karine Rebora, Jonathan R M Millet, Xiao Liu, Stuart K Kim, Denis Dupuy, Erik M Jorgensen, Andrew Z Fire 

前々投稿に続き生殖腺でのサイレンシングのルールの報告。連続したAもしくは連続したTが約10塩基ごとに周期的に並ぶような配列（PATC）が非翻訳領域にある場合に、遺伝子がサイレンシングを逃れて発現する。Frøkjær-Jensenら。2016年。

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867416306766

外来遺伝子を生殖腺もしくは初期胚で高発現させたい場合は、PATCを多く含むイントロン（smu-1遺伝子のイントロンなど）を入れれば、安定して発現しやすくなる（前々投稿のpiRNAの論文でも使用）。

https://science.sciencemag.org/content/359/6375/587

（12月9日追記）

PATCを多く含むイントロンの挿入など様々な方法を組み合わせて、外来遺伝子を生殖腺で（ゲノムに挿入せずに）簡単に安定発現させる方法の報告。KAUST（サウジアラビア）のFrøkjær-Jensen研。2020年12月9日。

https://www.nature.com/articles/s41467-020-19898-0

The piRNA targeting rules and the resistance to piRNA silencing in endogenous genes

Science. 2018 Feb 2;359(6375):587-592.

Donglei Zhang, Shikui Tu, Michael Stubna, Wei-Sheng Wu, Wei-Che Huang, Zhiping Weng, Heng-Chi Lee.

piRNAが生殖腺で標的遺伝子の発現を抑制する際の配列の法則の報告。piRNA標的配列の使用を避ければ、生殖腺で外来遺伝子を発現させやすくできる。例えばCas9を高発現させてゲノム編集の効率を上げられる。シカゴ大学Lee研。2018年。

https://science.sciencemag.org/content/359/6375/587

phiC31 integrase for recombination mediated single copy insertion and genome manipulation in C. elegans

bioRxiv

Fang-Jung Yang, Chiao-Nung Chen, Tiffany Chang, Ting-Wei Cheng, Ni-Chen Chang, Chia-Yi Kao, Chih-Chi Lee, Yu-Ching Huang, Shih-Peng Chan, John Wang

PhiC31組み換え酵素を発現する株を使って、attB配列に挟まれた外来長鎖DNAのゲノムへの挿入や、長い染色体領域のinversionなどを起こす手法。効率良さそうだが普及するだろうか。台湾・中央研究院のWang研。2020年プレプリント。

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.11.25.398784v1

An Aneuploidy-Free and Structurally Defined Balancer Chromosome Toolkit for Caenorhabditis elegans

Cell Rep. 2018 Jan 2;22(1):232-241.

Katsufumi Dejima, Sayaka Hori, Satoru Iwata, Yuji Suehiro, Sawako Yoshina, Tomoko Motohashi, Shohei Mitani.

CRISPR/Cas9で染色体に逆位を２回起こしたバランサー株を多数作製。蛍光マーカーや形態異常変異の組み合わせでバランサーの維持が容易。様々な用途で感動的に便利。東女医大の三谷研究室。2018年。

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211124717318338

なぜバランサーを作るのに逆位を２回起こす必要があるのか、１回ではだめなのか？という点は、例えば下記サイトのFig 17-16あたりを見れば価値がわかりやすい？ １回の逆位では、染色体がループ構造をとってうまく対合し、組み換わって異数体（aneuploidy）になってしまう。

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22042/